Ćw.5 - protokół, Biotechnologia UR Kraków, Semestr IV (2015), Inżynieria genetyczna, Ćwiczenia na WBiO
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Ćwiczenia 5 – ligacja pDNA i produktu PCR1. Przygotowanie szalek z pożywką selekcyjnąPożywkę LB-agar rozpuścić w kuchence mikrofalowej, a następnie schłodzić podbieżącą wodą do temp. ok. 60ᵒC (butelka z pożywką ma być gorąca ale nie możeparzyć dłoni).Do pożywki dodać następujące składniki:antybiotyk (ampicylina) – stężenie docelowe antybiotyku w pożywce mawynosić 100 µg/ml (rodzaj i stężenie antybiotyku zależą od wprowadzonegoplamizdu);IPTG – 100 µl/szalka;X-Gal – 20 µl/szalka.Na każdą szalkę wylać ok. 30 ml pożywki. Szalki z pożywką przykryć częściowowieczkiem i zostawić pod komorą do zastygnięcia.2. Nastawienie reakcji ligacji pDNA i produktu PCRSkładniki mieszaniny ligacyjnej muszą znajdować się w odpowiednim stosunkumolowym (1 : 3 --> wektor : klonowany DNA).Stężenie preparatów DNA trzeba przeliczyć na pmole, a następnie obliczyć proporcjęmasową składników mieszaniny reakcyjnej wg wzorów:, gdzie:N – liczba nukleotydów,660 pg/pmol – średnia masa cząsteczkowa pary nukleotydów.Po uproszczeniu:Przykład:Długość pDNA = 3 000 pzIlość pDNA użyta do ligacji = 50 ng = 0,05 µgObliczamy liczbę pmoli pDNA:Do ligacji potrzebujemy zatem 3× więcej produktu PCR jako insertu, czyli:. Korzystając z drugiego wzoru obliczamy ilu µg odpowiada0,075 pmol produktu PCR o długości 300 pz:Zatem zakładając reakcję ligacji, 50 ng pDNA należy wymieszać z 14,85 ng insertu(produktu PCR) aby zachować stosunek molowy (1 : 3 --> wektor : klonowany DNA).Na podstawie wyników pomiaru stężenia pDNA i produktu PCR pooczyszczeniu obliczyć objętości poszczególnych komponentów, które należy dodać domieszaniny reakcyjnej:H2Odo 20 µlpDNA20 – 100 ng1:3produkt PCRwektor : insertBufor do ligazy50% PEGligaza2 µl2 µl5 µlUwaga:bufor ligacyjny po rozmrożeniu może zawierać nierozpuszczone kryształkiATP. Jeżeli są widoczne, to trzeba je rozpuścić przez delikatnie podgrzanie buforu wdłoni i zworteksowanie.Po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej:Wortex --> quick-run --> termocykler ustawiony na 22C (inkubacja przez godzinę)
[ Pobierz całość w formacie PDF ]