Ćw. 05 Antygeny zgodności tkankowej. Test mikrolimfocytotoksyczny, Biol UMCS, V semestr, Immunologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Ćw. 5 – Antygeny zgodności tkankowej.Test mikrolimfocytotoksyczny wg Terasaki.Antygeny zgodności tkankowej– glikoproteiny powierzchniowe obecne w błonach komórkowych,występują u kręgowców, są odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepów allogenicznych.••MHC–Major Histocompatibility Complex– zespół genów kodujących antygeny zgodnościtkankowej, położonych u człowieka na chromosomie 6.HLA – Human Leukocyte Antigens– antygeny zgodności tkankowej występujące u człowieka.Długośd przeżycia przeszczepów narządowych jest uwarunkowana stopniem zgodności HLAmiędzy dawcą a biorcą przeszczepu (antygeny transplantacyjne).Rys. Schemat mapy genetycznej układu HLA.Klasy MHC:MHC klasy pierwszej:•prezentują antygeny limfocytom Tc, doprowadzając do lizy komórkizainfekowanej np. wirusami lub bakteriami wewnątrzkomórkowymi,np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosiswystępują na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych (nieliczne naerytrocytach)są kodowane przez polimorficzne geny okupujące trzy loci:HLA-A, HLA-B, HLA-C,w obrębiekażdego locus opisanood kilku do kilkunastuswoistości antygenowychu człowieka ze względu na diploidalny komplet chromosomów i dziedziczenie MHC jakocechy kodominującej zwykle wykrywa się po dwa antygeny z każdego locusBudowa:-łaocuch ciężki –α(45 kDa)fragment zewnątrzkomórkowy - 3 domenyα1, α2(tworząrowek wiążący9aa antygen), α3fragment hydrofobowy – częśd transbłonowafragment hydrofilowy – częśd cytoplazmatyczna-łaocuch lekki –β2-mikroglobulina(β2m) (12 kDa) – kodowanyprzez gen na chromosomie 15, czynnik „wyciągający” łaocuch α nazewnątrz komórki••••MHC klasy drugiej:•prezentują antygen limfocytom Th, doprowadzając do aktywacji układuimmunologicznego poprzez wpływ na:-odpowiedź humoralną:Th2 - IL-4, IL-5 IL-6-odpowiedź komórkową:Th1 – IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-βwystępują na powierzchnilimfocytów B, makrofagów, komórekdendrytycznych i nabłonkowych grasicysą kodowane w regionieD,który składa się z kilkunastu bliskopołożonych loci, zgrupowanych w subregiony:HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DRwykrytokilkasetswoistości antygenowych kodowanych przez te genyBudowa:-łaocuchα(33 kDa) i łaocuchβ(29 kDa) – częśdwewnątrzkomórkowa, transbłonowa i zewnątrzkomórkowa-częśd zewnątrzkomórkowa – domeny α1i α2oraz β1i β2-domeny α1i β1– tworzą rowek wiążący 20aa antygen••••MHC klasy trzeciej:••Składowe dopełniacza:C4, C2, BWystępująw plazmie krwii odgrywają niewielką rolę w odrzucaniu przeszczepówFunkcje MHC:••Główna funkcja MHC to wiązanie i prezentacja antygenu limfocytom THeterozygoty wykazują lepszą możliwośd prezentacji większej ilości antygenów, apolimorfizm MHC zwiększa przeżycie niektórych osobników w populacji podczas epidemiiśmiertelnych chorób!!!Różnorodnośd cząsteczek MHC jest wynikiem przystosowania się układu immunologicznegodo walki z mikroorganizmami•Metody identyfikacji HLA:•••Typowanie serologiczne oparte na przeciwciałach anty-HLA, najczęściej monoklonalnych (np.test Terasaki)Typowanie genetyczne określające polimorfizm na poziomie DNAAnaliza fragmentów restrykcyjnych produktu PCR (PCR-RFLP) i porównanie z określonymiwzorcamiTypowanie HLA jest istotne w:-transplantologii-diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między ekspresją HLA-B27 azesztywniającym zapaleniem kręgosłupa)-ustalaniu ojcowstwa-medycynie sądowejTest mikrolimfocytotoksyczny wg. Terasaki (wykrywanie HLA kl. I)Izolacja limfocytów - wykonanie:1. Odwłóknioną przez wytrząsanie z perełkami szklanymi krew rozcieoczono PBS w stosunku 1:12. Otrzymaną zawiesinę nawarstwiono na Lymphoprep w proporcji 2:1 (np. 6ml krwi i 3mlLymphoprepu) i wirowano przez 15 min (400xg)3. Zebrano limfocyty z interfazy (pierścieo znajdujący się między Lymphoprepem a osoczem) ipłukano je 2-3x PBSem oraz rozcieoczono PBS do gęstości 2x106kom/ml4. Limfocyty kontrolne, przechowywane w ciekłym azocie odmrożono przez zanurzenieampułki w wodzie o temp. 37°C, następnie płukano PBS i przygotowano zawiesinę o gęstości2x106kom/mlTest Terasaki - wykonanie:1. 72-dołkowe płytki Terasaki na których przeprowadza się test należy odpowiednio oznakowadi wszystkie zagłębienia wypełnid do 2/3 objętości olejem parafinowym (uwaga! na dniezagłębieo nie może byd pęcherzyków powietrza)2. Do każdego zagłębienia, pod parafinę, wkrapla się przy pomocy mikrostrzykawki Hamiltona opojemności 50 µl po 1 µl surowicy wzorcowej anty-HLA (uwaga! Przy każdej zmianie surowicystrzykawkę trzeba dokładnie przepłukad w PBS (10x), aby uniknąd przeniesienia surowicy zjednego dołka do drugiego)3. Zagłębienie oznaczone1Aprzeznaczone jest na kontrolę żywotności limfocytów, więczamiast surowicy wzorcowej dodajemy tu 1 µl PBS(kontrola negatywna)natomiast do dołka1Bdodajemy wzorcowe limfocyty i wybraną wzorcową surowicę(kontrola pozytywna)4. Do wszystkich dołków (z wyjątkiem 1B) dodajemy po 1 µl zawiesiny badanych limfocytów ogęstości 2x103kom/1 µl PBS5. Płytki inkubujemy z wytrząsaniem przez 30 min w 20°-24°C6. Następnie do każdego dołka dodajemy po 5 µl króliczego dopełniacza i inkubujemy próbki zwytrząsaniem przez 60 min w 20°-24°C7. Po inkubacji do każdego dołka dodajemy po 5 µl 5% roztworu eozyny żółtawej, a po 3 min po5 µl 38% roztw. formaldehyduDopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich lizę. W dołkach, wktórych limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy antygenem HLA a skierowanymprzeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]