Ćwiczenie 6 - testy identyfikacyjne 2012, mikrobiologia UAM ochrona środowiska, ćwiczenia Baranek
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Ćwiczenie 6
(MOi)
Tktywnoć biochemicnaiijologicnabakteriinawybranychpodłożachidentyikacyjnychTety
identyfikacyjne.
I)
Podłoża identyfikacyjne
łużądookrelaniaprynależnocibakteriidokonkretnegogatunkunapodtawie
ich cech biochemicnych i ijologicnych by w pełni identyikować szczep
bakteryjnyokrelaiwykleconajmniej20takichcech
1)
Wykorytaniecukrówialkoholiwielowodorotlenowych
a)
wykorytaniecytrynianujakojedynegoródławgla
b)
wykorytaniemalonianujakojedynegoródławgla
c)
wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)
d)
rokładcukru/alkoholuwydieleniemgau(podłożerurkąDűrhama)
e)
ermentacjaglukoy(podłożeH-L, Hugh-Leion’a)
f)
wytwarzanie acetoiny (test Voges-Proskauer) [T]
2)
Metabolimwiąkówaotu
a)
dekarboksylacja lizyny i ornityny
b)
dwuhydroksylaza argininy
c)
dezaminacja fenyloalaniny [T]
d)
wytwarzanie indolu (SIM) [T]
e)
wytwarzanie H
2
S (SIM)
f)
ruch (SIM)
g)
rokładmocnika(ureaa)
h)
redukcjaaotanówdoaotynówT
1)
tetnaokydacytochromową
2)
tetnaobecnoć katalazy
3)
tetnaobecnoć koagulazy
tetprobówkowy
CF (Clumping Factor)
1
1.
Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych
a)
tetnapodłożuimmonanawykorytaniecytrynianujakoródła
wglacytrynian– jedyneródłowglawpożywce
fosforan amonu – jedyneródłoaotu
błkitbromotymolowy– wkanik
BakteriepoykującecytrynianpodłożaalkaliująpożywkReagujebłkit
bromotymolowymieniającbarwielonejnaniebiekąbybakteriepoykiwałyi
rokładałycytrynianmuąmieć odpowiedniąpermea(tranportdokomórki)oralia
cytrynianową
b)
tetnawykorytaniemalonianujakojedynegoródławgla
Jeżelibakteriemajądolnoć poykiwaniamalonianutoalkaliujątymamympodłożeireaguje
wkanik– błkitbromotymolowyBarwapodłożamieniaiielonejnaniebieką
c) wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)
Wpłynnympodłożunajdujei1-2%cukrulubalkoholuorawkanik– błkit
bromotymolowyWwynikurokładucukrulubalkoholupodłożeulegaakwaeniu
ReagujewkanikipodłożebarwyielonejmieniainażółtąJettoreakcjadodatnia
d)rokładcukru/alkoholuwydieleniemgau(podłożerurkąDűrhama)
Jest to tetnawykorytaniecukru/alkoholujednakwprobówcedodatkowoumieconajet
rurkaDűrhama(klanarurkaotworemjednejtronykierowanymwdół)Wytwaranie
gauoberwujeitylkowprobówkachdodatniąreakcjąnarokładcukrulubalkoholu–
cyliwtakichgdiepodłożeabarwiłoinażółtoJeżeliwrurcewidać pcherykpowietra
tobakteriewtrakciemetaboliowaniacukruwytwarajągaireakcjajetdodatniaJeżeli
podłożepootałoielonetodalyetapidentyikacjipomijai– reakcja jest ujemna.
e)ermentacjaglukoy(podłożeH-L, Hugh-Leion’a)
NapodłożuumieconajetwartwaparainyuniemożliwiającadotptlenuNatym
podłożutwierdamydolnoć bakteriidoermentacjiglukoyJeżeliwwarunkach
beztlenowych bakteriewykorytującukiertoakwaająpodłożeireagujebłkit
bromotymolowymieniającbarwielonejnażółtą
f) wytwarzanie acetoiny (odczyn Voges-Proskauer; V-P)
TettenwykonujeienapodłożuClarkaglukoąPoinkubacjidodajei
odpowiednieodcynnikiwcelutwierdeniaobecnociacetoiny
Acetoina jest produktem szlaku 2,3-butandiolowego:
glukoza -------> 2 x pirogronian-----(kondensacja, dekarboksylacja)----->
acetomleczan ---(dekarboksylacja)---->acetoina
acetoina ----(warunki beztlenowe, redukcja)--->2,3 butandiol
acetoina ----(warunkiutleniające)----> diacetyl
2
Wcelupreprowadeniatetudoprobówkidodajei
0,6 ml Alfa-Naftolu (silny utleniacz)
0,6 ml KOH (warunki alkaliczne)
Natpnieinkubujeiprobówk30minw37tC
Acetoina w warunkach zasadowych zostaje utleniona przy udziale alfa-naftolu do diacetylu.
Diacetylreagujeugrupowaniemguanidynowymktórewchodiwkładaminokwaów
(peptonitp)idajecerwonypiercieńWidocnypiercień to reakcja dodatnia.
2.
Metabolizm związków azotu
a)
dekarboksylacja lizyny i ornityny
Bakteriemająceodpowiednieenymy(dekarbokylaaliyny/ornityny)majądolnoć
prektałcaniaaminokwaówdoamin(liynydokadawerynyornitynydo
putrecyny)WytwaranietychenymówjetindukowanenikimpHpodłoża
Wkładpodłożawchodimin glukoachlorowodorekliyny/ornitynyorabłkit
bromotymolowy – conadajecałocibarwielonąBakterieinkubujei24godiny
anatpnieodcytujewynik
BakteriewpierwejkolejnocipobierająpodłożaglukoNatpujeakwaeniepodłoża
któreielonegoprechodiwżółte(reagujebłkitbromotymolowy)Popreakwaenie
natpujeaktywacjadekarbokylayliyny/ornitynyPowtałeaminokwaówaminyalkaliują
podłożeibarwyżółtejprechodionowieloną– zielona barwapodłożawiadcyoreakcji
dodatniej*Reakcjprowadimyrównoleglewkontrolnejprobówcepobawionejliynyi
ornitynyNależytakrobić ponieważniewiadomocywpróbiewłaciwejielonepodłożejet
wynikiem wykorzystania ornityny i lizyny czy po prostu dany szczep bakteryjny nie pobiera
glukoyiżadnareakcjawprobówcenieała
b)
dwuhydroksylaza argininy
PreprowadaienapodłożuTornley’awkładktóregowchodimincerwieoenolowa
(wkanik)oranawartwionajetparaina(warunkibeztlenowe).
rgininajetrokładanadwuetapowoDwuhydrolaaargininy(yndeymidaaargininy)
rokładaarginindocytrulinyiamoniakuWwynikudiałaniacytrulinay(ureidaycytruliny)
powstaje ornityna, amoniak i CO
2
Wtychdwóchreakcjachpowtająwicdwiecątecki
amoniakuktóryilniealkaliujepodłożeWkanikiemjetcerwień enolowaktóramienia
ilekkoróżowejbarwynailnieróżową
3
c)
dezaminacja fenyloalaniny
TetwykonujeinakoieagarowymWwynikudeaminacjienyloalanina przechodzi w
kwaenylopirogronowyktóryjonamiżelaowymidajecharakterytycneabarwienie
Dopodłożapoianymcepemdodajemy3%FeCl
3
(barwa pomarańcowa)Jeżeliodcynnik
pozostaje pomarańcowytoreakcjaujemnaJeżelimienibarwnaielono-maragdowąto
nacyżebakterienapodłożumajądolnoć do dezaminacji fenyloalaniny.
d)
wytwarzanie indolu (SIM)
Test przeprowadza sie napodłożuIMNiektórebakteriemajądolnoć doprektałcania
tryptofanu w indol, pirogronianiamoniakObecnoć indoluwpożywcewykrywaiea
pomocąodcynnikaKovac’a
kładodcynnikaKovac’a
para-2-metylo-amino-benzaldehyd
alkohol amylowy
tżHCl
Pododaniuodcynnikainkubujemyprobówk10minw37°CPowtałycerwonypiercień
wiadcyowynikudodatnim
e)
wytwarzanie H
2
S (SIM)
TetpreprowadaienapodłożuIMwkładktóregowchodimintioiarcan oduJeżeli
bakteriemajądolnoć doprodukcjireduktaytioiarcanowejtoredukujątioiarcandoH
2
S.
H
2
reagujenatomiatjonamiżelaawymiawartymiwpodłożuPowtajeiarcekżelaa(II)
którymabarwcarnąReakcjadodatnia– podłożeabarwione na czarno.
Bakteriemogątewytwarać deulhydracyteinyiwtedyredukująiarkaminokwau
cysteiny co daje taki sam efekt jak w przypadku redukcji tiosiarczanu.
ruch (SIM)
f)
PodłożeIMtopodłożetałePoiewjetwpotaciwkłuciaJeżeliwrotbakteriitylkow
miejcuwkłuciatobakterieniemajadolnociruchuJeżelinatomiatwrotwytpujew
całympodłożutowiadcyoruchliwocidanegocepu
g)
rokładmocnika (ureaza)
WykonujeitentetnapodłożuChritenenaawierającymmocnikicerwień enolową
(wkanik)Mocnikjetrokładanypreurea(rocinawiąaniapomidyCiN)Powtaje
amoniakidwutlenekwglaPodłożeulegaalkaliacjiireagujewkanikmieniającibarwy
lekkoróżowejnailnieróżową
4
h)
redukcjaaotanówdoaotynów
Itniejądwiedrogiredukcjiaotanów
asymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> hydroksyamina -> amoniak)
dysymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> podtlenek azotu ->aotcąteckowy)
TetpreprowadaienabulioniewykłymdodatkiemKNO
3
Bakterieredukujące
aotany(wytwarająceminreduktaaotanową)wykrywamypopreobecnoć
aotynów. Po inkubacji bakterii dodajemy dwa odczynniki:
Grie’a(kwulanilowy)
Grie’aB(ala-naftyloamina)
Odcynnikiłącąiaotynamiipowtajecerwonykomplekwiadcytooreakcji
dodatniej. Jednak brak czerwonego zabarwienia nie muiwiadcyć obrakuredukcjiaotanów
Być możewytkieaotynyotałyjuprektałconewdaleproduktylaku
metabolicznego.
Aby to sprawdzić dodajemypyłcynkowyPowodujeonnatychmiatowąredukcjaotanówdo
aotynówTakwicjeżeliwpożywcenadalbyłyniepretworoneaotanytoredukująii
utworąbarwnykomplekGrieiGrieBJeżelitakitanietonacyżetopyłcynkowy
redukowałaotanyaniebakteriewicreakcjajetujemnaJeżelinatomiatpododaniupyłu
cynkowegobarwaieniemienitonacyżebakterieprektałciływytkieaotany
Reakcja jest wtedy dodatnia.
1)
Tetnaokydacytochromową
Okydaacytochromowa(okydaacytochromuc)tootatniebiałkołańcucha
oddechowego. Przenosi elektrony na tlen. W celu wykrycia tego kompleksu u bakterii na
bibułnakrapiamyodcynnikKovac’a(2)(tetra-metyl-para-enylendiamina)Natpnie
nanoimycepbakteryjnyJeżeliwciągu10ekundpojawiiciemnoniebiekie
zabarwienie to reakcja jest dodatnia.
cepynanoimyeąplatynową(metallachetny)żebyapobiectranportowi
elektronóweynaokydacytochromową
ElektronyodcynnikaKovac’aprechodąnaokydaanatpnienatlenam
odcynnikprechodiwbłkitWűrtera(ciemnyniebiekikolor)
2)
Tetnaobecnoć katalazy
Katalaatoenymrokładającynadtlenekwodorudowodyitlenucąteckowego
Katalaapomaganiektórymbakteriombronić iprednadtlenkiemwodoru
produkowanympreukładimmunologicnyKatalawytwarająnaprykładgronkowce
3%rotwórnadtlenkuwodorunakrapiamynakoloniebakteryjneJeżelipowtająpcheryki
gau(tlen)toonacażebakteriewytwarająkatala
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]